Un primo gruppo di opere, proveniente dagli edifici delle corporazioni religiose soppresse, venne a costituire nel 1861 il nucleo principale della Galleria che, considerata una delle più preziose raccolte d'arte in Italia, fu istituita nel 1912, sotto la direzione di Lionello Venturi, l'allora soprintendente, con l'intento di raccogliere, custodire e valorizzare gli oggetti d'arte provenienti dall'intero territorio regionale.

Il percorso, all'interno del Palazzo, oltre a condurre il visitatore in ambienti di grande suggestione, tra cui lo "Studiolo del Duca", la "Cappellina del Perdono" e il "Tempietto delle Muse", lo avvicina alle numerose testimonianze della civiltà figurativa urbinate e a capolavori assoluti come: "La profanazione dell'Ostia" di Paolo Uccello (1397-1475), "La Flagellazione" e la "Madonna di Senigallia" di Piero della Francesca (1415/20-1492), la "Pentecoste" e la "Crocefissione" di Luca Signorelli (1441/50-1523), "La Muta" di Raffaello (1483 - 1520), l"Ultima Cena" e la "Resurrezione" di Tiziano (1487/88-1576), l'"Assunzione della Vergine" di Federico Barocci (1535 - 1612), la "Madonna col Bambino e Santa Francesca Romana" di Orazio Gentileschi (c.1563 - 638 o 46).

Di recente acquisizione la Collezione Volponi donata dallo scrittore urbinate che comprende, tra l'altro, dipinti del Trecento bolognese e tele del Seicento marchigiano.

Importanti le raccolte di disegni e incisioni, la collezione di ceramiche e maioliche dei secoli XV e XVI e il misterioso dipinto della "Città ideale" (1480 c.) che, assieme alle due "Prospettive" conservate una nella Walters Art Gallery di Baltimora e l'altra nello Schloss Museum di Berlino, costituì, come afferma Maria Grazia Ciardi Duprè, il punto di partenza di alcuni fra i maggiori problemi prospettici, urbanistici, di architettura e di spazio che, nel passaggio dal primo al secondo Rinascimento, fondarono la civiltà moderna.

Dopo gli ultimi restauri, è possibile visitare anche i sotterranei del Palazzo con la neviera, la selleria, la lavanderia, la cucina, la stalla ed il bagno del Duca.